Освячена 4 квітня 1691. Влаштована на місці келії, де були мощі першого ігумена Печерського Варлаама. 1703 храм мав традиційний для підземної лаврської архітектури вигляд. Вузький вхід з боку Печерної вулиці вів до прямокутного приміщення, видовженого по осі схід—захід і перекритого півциркульним склепінням. Церква не мала внутрішнього поділу, за винятком північного аркасолію для мощей преп. Варлаама. Вузькими ходами вівтарна частина з'єднувалася з келією Антонія та з поперечним провулком, вздовж якого була орієнтована. Після пожежі 1718, що знищила майже всі будівлі верхньої території Лаври, проведено великі роботи з реконструкції підземних храмів. Усі церкви Ближніх печер ґрунтовно перебудовано та збільшено. Значних змін зазнала церква преподобного Варлаама Печерського. Внаслідок розширення аркасоліїв її поділено на окремі об'єми, всю східну частину (притвор) звужено і перенесено південніше. Тоді ж у церкві було встановлено два мармурові одвірки з порталів собору Успіння Пресвятої Богородиці Лаври. Іконостас 1818 виконав київський золотар Ф. Коробкін (Коробка).

Церква складається з двох підземних об'ємів: перекритої зімкнутим склепінням нави та притвору, що просторово поєднаний з провулком. Паралельні планувальні осі цих приміщень пролягають на відстані одна від одної. Наву поділяють на три частини бічні аркасолії та встановлені на поперечній осі два мармурові одвірки, які утворюють своєрідну раму перед іконостасом. Входи в церкву з провулка — через притвор та арковий отвір у південній стіні нави. У північну стіну притвору вмонтовано кам'яну меморіальну дошку з гравірованим орнаментальним написом на зразок в'язі про побудову церкви та початок служби у ній. Іконостас являє собою триярусну конструкцію з позолоченої міді з центральними царськими та розташованими ліворуч дияконськими вратами. Композиційно-ритмічний лад іконостаса й орнаментальне оздоблення послідовно витримано у стилі класицизм з притаманною йому рівновагою та чіткою регулярністю геометрично правильних форм. Його вирізняє гармонійна узгодженість пропорцій як в цілому, так й окремих елементів. Гладінь присадкуватої позолоченої стіни, завершеної лучковим фронтоном, урізноманітнено вишукано-лаконічними декоративними елементами: вінками, гірляндами, квітковими розетками, фільонками і гуртами. У рисунку рослинних деталей присутня соковита пластичність й енергійна пружність форм, традиційна для бароково-рокайлевої орнаментики. Декоративним акцентом іконостаса є ажурний візерунок царських врат, вирішених у вигляді вертикальних ґрат, оплетених пагонами з дрібним, вибагливої форми листям, серед якого вкомпоновано шість медальйонів у рослинних карбованих обрамленнях. На чотирьох верхніх зображено євангелістів. Образи святих Матфея та Марка наполовину втрачено внаслідок осипання фарб, Луки та Іоанна — у задовільному стані. Зображення відзначаються насиченим колоритом яскравих прозорих фарб, гармонізованих на основі теплих золотавих відтінків тла. В нижніх медальйонах вміщено цитати з Євангелій. Верхню частину трилопатевої арки заповнює карбоване з тонкої міді променисте сяйво навколо медальйона з голубом — символом Святого Духа, зображення якого втрачено, як і корону на вершині стулок врат. Цілісністю задуму та виконання позначені образи, намальовані олійними фарбами на мідних дошках. Ікони середнього, найбільш значущого, ярусу: намісні образи «Христос на престолі», «Богоматір», «Архангел Михаїл», «Собор святих отців Печерських» доповнено іконою «Смерть преп. Варлаама». Вона є дещо незвичним варіантом храмового образа. Тут замість узагальненого зображення постаті Варлаама представлено конкретний, хоча й кульмінаційний, епізод його життя. Ікона продовжує і завершує драматичну оповідь про життя святого, розгорнену в нижньому ярусі іконостаса на основі текстів «Києво- Печерського патерика» (1661) та гравюр Л. Тарасевича 1702: ліворуч «Батько силоміць забирає Варлаама з печери», «Варлаам та його дружина», «Варлаам скидає багатий одяг»; праворуч: «Христос», «Прощання Варлаама з родиною», «Постриг преп. Варлаама». Образи Христа, Богоматері, архангела Михаїла написано найбільш академічно, стримано й строго, у дещо висвітленій, бляклій кольоровій гамі брунатно-рожевих, сизо-сірих, зеленкувaтих та світло-жовтих відтінків. Іконографічна основа їх модифікована в дусі академізованого іконопису поч. 19 ст., де візантійська основа (типи Одигітрії та Христа Пантократора) поєднується з впливами західноєвропейського мистецтва 16—18 ст. Малюнок, моделювання форм хоча й наслідують академічні зразки, проте мають ряд спрощень і похибок, особливо у зображеннях численних ангелів, які вносять у композиції з Христом і Богоматір'ю елемент оповідності та жанрове пожвавлення. Інший характер мають житійні ікони преп. Варлаама та «Собор усіх святих Печерських». Виконані в тонкій манері лесування, вони відзначаються насиченішим колоритом та контрастним світлотіньовим моделюванням. Слідом за Л. Тарасевичем іконописець звертається до найдраматичніших епізодів житія преподобного, зосереджуючи увагу на емоціях героїв. Особливою експресією позначена сцена прощання Варлаама з рідними, в якій вдало поєднано для змістовного розкриття сюжету ритм рухів, напружене зіставлення контрастних кольорів та спалахи освітлення. У тимпані фронтону в медальйонах у манері, подібній до намісних образів іконостаса, зображено по центру «Новозаповітну Трійцю», обабіч неї — чотири групи «Апостолів» та «Пророків». Центральна композиція — у пишному декоративному обрамленні з променистого ореолу на зразок орденської зірки та вигинів стилізованого аканта — вирізняється високими художніми якостями і нагадує емалеві клейма на коштовних оправах лаврських стародруків. Іконостас церкви преподобного Варлаама Печерського є класицистичним та найбільш вишуканим серед іконостасів печерних церков Лаври. Його висока художня якість і єдність декоративно-архітектурної основи та іконопису, неординарне композиційне рішення розімкненого простору храму — зосереджено камерне і динамічне водночас, надають підземній церкві неповторного характеру.
У церкві встановлено раку з мощами преп. Варлаама Печерського [1479].